Ultramikrotomie

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Ultramikrotomie und Kryo-Ultramikrotomie
(siehe auch Mikrotomie und in-situ-Ultramikrotomie)

Allgemeines

Die Ultramikrotomie hat sich zu einer bedeutenden mikroskopischen Untersuchungstechnik zur Präparation von verschiedenen Materialien weiterentwickelt, wobei eine sehr ausgereifte Gerätetechnik zur Verfügung steht. Die Präparationstechnik zum erfolgreichen Herstellen von dünnen und ultradünnen Schnitten, sowie einen Überblick über Probleme und Fehler und die Beseitigung deren Ursachen wird von Michler in [1] erläutert.

Präparationstechnik

Ein Ultramikrotom ist ein empfindliches Schneideinstrument, in dem eine Probe an einem feststehenden Messer aus Glas oder Diamant vorbeigeführt wird (Bild 1). Der Probenarm mit daran befestigtem Probenhalter und Probe wird bei jedem Zyklus um einen bestimmten, einstellbaren Betrag in Richtung auf das Messer bewegt.

Bild 1:

Schematische Darstellung der Relativbewegung von Probe und Messer beim Schneidevorgang (A – Vorschub, B – Rückzug des Probearms)

Während des Schneidevorganges (zwischen den Punkten B und C2 in Bild 2) wird von der Probe ein Schnitt in der Dicke des Vorschubes erzeugt. Die genaue Schnittdicke wird außer durch den eingestellten Vorschub wesentlich auch durch andere Parameter wie Messerart, -qualität und -winkel sowie durch das Probenmaterial und die Schnittgröße bestimmt. Das Schneiden erfolgt mit einer in einem weiten Bereich einstellbaren Schneidegeschwindigkeit, welche abhängig vom Probenmaterial und der Schnittgeometrie optimiert werden muss. Die Rückführung der Probe (D) geschieht mit einer von der Schneidegeschwindigkeit abhängigen Geschwindigkeit in der Art, dass die Zeit für einen Gesamtzyklus (A1 – C1 – D) konstant ist.

Bild 2:

Schematische Darstellung der Geschwindigkeitsvariation des Präparatträgerarms beim Schneidezyklus

Die Ultramikrotome können mit einem thermischem oder mit einem mechanischen Vorschub des Probenarms versehen sein. Der thermische Vorschub basiert auf dem physikalischen Prinzip der Thermo-Expansion. Der Halterarm wird an einer Seite fixiert, so dass bei dessen Erwärmung die Ausdehnung nur zur Seite des befestigten Präparates wirksam wird, d. h. also in Richtung des Messers. Nachteil dieser Technik ist, dass die Konstanz des Schneideprozesses wegen der Trägheit des Expansionssystems bei jeder Änderung der Wärmezufuhr mehr oder weniger gestört wird. Neuere Geräte dieser Bauart verfügen über eine automatische Konstanthaltung des Vorschubs, wenn der Schneidevorgang zur Entnahme der Schnitte u. dgl. angehalten werden muss.

A1 – A2	hohe Geschwindigkeit
A2 – C2	eingestellte Schneidegeschwindigkeit
B	Beginn des Schneidevorganges
C2	Ende des Schneidevorganges
C2 – C1	hohe Geschwindigkeit
D	automatischer Rückzug des Probenarms bis zum Ausgangspunkt
A1	Vorschub (gewünschte Schnittdicke) und Beginn des neuen Schneidezyklus

Der in modernen Geräten benutzte mechanische Vorschub basiert auf einem Feinmechaniksystem mit Schrittmotor. Der mechanische Vorschub kann genau über die Digitalreglung eingestellt werden, so dass theoretisch Schnittdicken von 0 µm bis zu einigen Mikrometern möglich wären. Die wirkliche Schnittdicke ist aber von dem zu schneidenden Material und den eingestellten Parametern abhängig.

Die erhaltenen Schnitte werden zumeist in einem mit Flüssigkeit gefüllten Trog des Messers aufgefangen, anschließend auf Trägernetzchen aufgenommen und im Mikroskop untersucht.
Moderne Geräte sind mit Videokameras zur Demonstration und mit Computern zur Dokumentation z. B. der Schneideparameter ausgestattet.

Anwendung der Kryo-Ultramikrotomie

Wichtig für ein schnelles und sauberes Arbeiten ist die einfache und rasche Umrüstung des Ultramikrotoms zum Kryo-Ultramikrotom durch Aufsetzen der Kühlkammer auf die Gehäuseschale. Damit können Probe und Messer getrennt gekühlt werden. Während die Probenkühlung je nach Material bis zu etwa –185 °C eingestellt werden kann, reicht für das Messer eine geringere Kühlung aus. Soll hierbei mit Abschwemmflüssigkeiten (z. B. Alkohol) gearbeitet werden, begrenzt deren Gefrierpunkt die Messertemperatur. Beim Schneiden mit Alkohol als Abschwemmflüssigkeit muss berücksichtigt werden, dass aufgrund der geringen Oberflächenspannung des Alkohols die Schnitte sinken und auch stark komprimiert werden können. Für die Untersuchung biologischer Proben bzw. feuchter Polymerproben auch im gefrorenen Zustand im Elektronenmikroskop ist eine Kryotransfereinrichtung erforderlich.

Ein Schneiden bei tieferen Temperaturen ist dann erforderlich bzw. vorteilhaft, wenn die zu schneidenden Materialien zu weich sind und durch Abkühlung gehärtet bzw. fixiert werden können (z. B. bei Polymeren durch Abkühlung auf einige 10 K unter ihre Glastemperatur). Die Kühlung erfolgt in speziellen Kühlkammern als Aufsatzteile für die Ultramikrotome mittels flüssigen Stickstoff bis herab zu –150 °C oder bis –180 °C. Als Messer können neben normalen Glasmessern spezielle Kryo-Diamantmesser für das Nass- und Trockenschneiden eingesetzt werden.

Nach dem Antrimmen des Probekörpers werden die Probe und das Messer in die Kühlkammer eingebaut. Es muss gewartet werden, bis die Probe und das Messer die eingestellte Temperatur erreicht haben. Probe und Messer können separat gekühlt werden, wobei das Messer weniger stark gekühlt werden muss. Bei Verwendung von Auffang- bzw. Abschwemmflüssigkeiten ist die Messertemperatur begrenzt. Sie kann bei Verwendungen von p.a. (pure analysis) Alkohol bis –55 °C betragen. Bei einem DMSO (Dimethylsulfoxid) -Wasser-Gemisch sind noch tiefere Temperaturen erreichbar.

Anschließend können Schnitte mit den gewünschten Dicken hergestellt werden. Soweit die zu schneidenden Proben noch nicht die erforderliche Härte aufweisen, muss die Probentemperatur weiter gesenkt werden.

Beim Kryoschneiden ist eine Kontrolle der Schnittdicke über die Interferenzfarben nicht mehr möglich. Bei Ultramikrotomen mit thermischen Vorschub helfen nur Erfahrungswerte und nachträgliches Kontrollieren in einem Auflichtmikroskop. Vorteilhaft ist hier der Einsatz von Geräten mit mechanischem Vorschub.

Literaturhinweise

[1]	Michler, G. H., Lebek, W.: Ultramikrotomie in der Materialforschung. Carl Hanser Verlag, München (2004) S. 68–71 und 110–112 (ISBN 3-446-22721-0; AMK-Büchersammlung unter F 5)